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    公开号:WO1990013665A1
    申请号:PCT/JP1990/000558
    申请日:1990-04-27
    公开日:1990-11-15
    发明作者:Yoshihiro Oyama；Shuntaro Hosaka；Tetsuya Makino
    申请人:Toray Industries, Inc.；
    IPC主号:C12Q1-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 書
    [0002] 高感度発光分析方法
    [0003] 技 術 分 野
    [0004] 本発明は、 臨床検査、 食品検査、 環境分析、 動植物検 查、 製造工程管理検査などの領域で、 酵素反応、 抗原抗 体反応、 核酸ハイブリ ッ ド反応などを利用して化学発光 測定による高感度分析を行なう方法に関する。
    [0005] 背 景 技 術
    [0006] ペルォキシターゼによるルミ ノール、 イ ソルミ ノール またはそれらの誘導体 〔以下、 化学発光性 D P D (2, 3—ジヒ ドロー 1 , 4一フタラジンジオン） と略記〕 の 酸化を用いた発光反応は、 ィムノアツセィ、 エラスター ゼの分析、 グルコースの分析、 酸化剤の分析などに利用 されている。
    [0007] 上述の発光反応の発光強度を向上させるために、 次の ようなェンハンサーを反応系に添加すれば効果があるこ とが知られている。
    [0008] ① 6— ヒ ドロキンべンゾチアゾ一ル
    [0009] (特開昭 5 9 - 5002 52号公報）
    [0010] ② ある種の置換基を有するフ ヱノール
    [0011] (特開昭 5 9— 1 7 1 § 3 9号公報）
    [0012] ③ ある種の芳香族ァミ ン
    [0013] (特開昭 6 1 — 544 53号公報） '
    [0014] しかしながら、 上記の各ェンハンサ一には次のような 問題がある。 ①は多く の場合、 発光量が少なく、 シグナル対バック グラゥン ド比が小さい。
    [0015] ②の代表的ェンハンサ一は p—ョ一 ドフヱノールであ り、 その発光シグナルは高いが、 バックグラウン ドも高 く、 シグナル対バックグラウン ド比は低い。
    [0016] ③の代表的ェンハンサー N, N, Ν' , Ν' ーテトラ メチルべンジジンの場合は、 発光ピークの立 上がりが 遲く 、 測定に時間がかかる。
    [0017] また、 ェンハンサー効果の反応機構に関しては、 ノレミ ノールセミキノ ンラジカルの効率的生成の必要性
    [0018] [Thorpe, G. H. G and ricka.L. J . ： "Bioluminescence and Chemi luminescence ： New perspectives" , Scholme rich, J., Andreesn.R.. Kapp. A.. Ernst, M. and Woods, V.G. (Eds) . John Wiley, Chichester, pp.199-208. (19 87) 〕 、 およびフヱノキシラジカルの効率的生成の必要 性 Hodgson.M. and Jones. P : Journal of Biol uminesc ence and Chenii luminescence Vol .3. pp.21-25. (1989)〕 が提唱されている。
    [0019] しかしながら、 フエノール誘導体の中にもェンハンサ 一効果を示さない化合物が多数あり、 上記の理論だけか ら有効なェンハンサーを選別することは困難である。
    [0020] また、 病原性微生物中の遺伝子の検出、 プロスダグラ ンジンなどの生理活性物質の定量、 黄体化ホルモン （L H) などの脳下垂体前葉から放出されるホルモン、 イ ン ターロイキンなどの血中のサイ トカイ ンなどは、 いずれ も体液中の僅かな量を測定する必要があり、 高感度検出 系が求められ、 検出感度向上のためにさらに効率の高い ェンハンサ一が望まれていた。
    [0021] 本発明は、 新規ェンハンサ一の存在下に行なう ことを 特徵とする高感度発光分析を行なう ことを目的とする。 また、 本発明により従来公知のェンハンサ一より高効率 のェンハンサーを用いた発光分析を可能と し、 さらにェ ンハンサ一と して有効な新規ォキサゾール誘導体をも提 供することを目的とする。
    [0022] 発 明 の 開 示
    [0023] 本発明は、 （a) ペルォキシダーゼまたはペルォキシダ ーゼ誘導体、 （b〉 酸化剤および （c)ルミ ノール、 ィ ソル ミ ノールまたはそれらの誘導体の反応により生ずる化学 発光を利用して、 物質を検出または測定する方法におい て、 誘発光反応を 2—ヒ ドロキシー 9一フルォレノ ン、
    [0024]
    [0025] および一般式
    [0026] 〔式中、 R i は水素、 C n H 2 n+ 1 (こ で、 n は 1〜 4の正の整数を表わす） 、 X C n H 2 n ( こで、 Xは F C 1 、 B r または I を表わし、 nは前記定義に同じ） 、 C n H2n+1C 0 £ ( n は前記定義に同じ） 、 フヱニル 基、 ナフチル基、 Cn H2n+1C6 H4 (nは前記定義に 同じ） 、 Y C 6 H （ Yは F、 C 1、 B r、 I またはフ ェニル基を表わす） 、 XY C6 H3 (X、 Yは前記定義 に同じ） を表わす〕
    [0027] で示される新規なォキサゾール誘導体からなる群から選 ばれる少なく とも 1つの化合物の存在下に行なうことを 特徵とする高感度発光分析方法に関するものである。
    [0028] 図面の簡単な説明
    [0029] 第 1図および第 2図は本発明のェンハンサーである 2 ーヒ ドロキシー 9一フノレオレノ ンと公知のェンハンサー を用いて、 C A 1 5— 3の分析を行なった結果を比較し たものであり、 第 1図は 5秒後の発光強度の S N比を、 第 2図は 1 0秒後の発光強度め S N比を各々示す。
    [0030] 第 3図は本発明のェンハンサーを発光系に添加した場 合としなかった場合で、 C A 1 5— 3の分析を行ない、 結果を比較したものである。
    [0031] 第 4図は実施例 1 9で得られた 2—クロロメチルー 6 ーヒ ドロキシベンゾォキサゾールの I Rスぺク トルであ り、 第 5図はその NMRスぺク トルである。
    [0032] 第 6図は実施例 20で得られた 2—ェトキシカルボ二 ルー 6—ヒ ドロキシベンゾォキサプールの I Rスぺク ト ルであり、 第 7図はその NMRスぺク トルである。
    [0033] 第 8図は実施例 2 1で得られた 2— （3—ブロモフエ ニル） 一 6—ヒ ドロキシベンゾォキサゾールの I Rスぺ ク トルであり、 第 9図はその NMRスぺク トルである。 第 1 0図は実施例 22で得られた 2— （ 2—メチルフ ェニル） 一 6— ヒ ドロキシベンゾォキサゾールの I Rス ぺク トルであり、 第 1 1図はその NMRスぺク トルであ る。
    [0034] 第 1 2図は実施冽 3 5で得られた 2— （3—クロロフ ェニル） 一 6— ヒ ドロキシベンゾォキサゾールの I Rス ぺク トルであり、 第 1 3図はその N MRスぺク トルであ る。
    [0035] 第 14図は実施例 36で得られた 2— （4ークロロフ ェニル） 一 6—ヒ ドロキシベンゾォキサゾールの I Rス ぺク トルであり、 第 1 5図はその NMRスぺク トルであ る o
    [0036] 第 1 6図は実施例 37で得られた 2— （2—ナフチル） 一 6—ヒ ドロキシベンゾォキサゾールの I Rスぺク トル であり、 第 1 7図はその NMRスぺク トルである。
    [0037] 第 18図は実施例 38で得られた 2— （ 2, 4—ジク ロ ロ フ エ二ノレ） 一 6— ヒ ドロキ シベ ンゾォキサゾ一ノレの I Rスぺク トルであり、 第 1 9図はその NMRスぺク ト ルで,ある。
    [0038] 第 20図は実施例 5 1および比較例 22で得られた S N値を示したものである。
    [0039] 発明を実施するための最良の形態
    [0040] 本発明のェンハンサーである 2— ヒ ドロキシー 9ーフ ノレオレノ ン、
    [0041]
    [0042] [ 4ーヒ ドロキシ一 3— 〔3— （4ーヒ ドロキシフヱ ニル） 一 1 一ォキソ一 2—プロぺニル〕 一 2 Η—
    [0043] 1 一べンゾピラン一 2—オン （以下、 Η Η Β Ρと略 す） ]
    [0044] または、 [ I ] 式に示すォキサゾール誘導体による化学 発光増強効果は、 ペルォキシダーゼ 酸化剤ノ化学発光 性 D P D系で得られる発光シグナル対バックグラゥ ン ド 比が、 本発明のェンハンサーをその系に添加することに より著しく向上することで確認できる。 ここで用いたバ ックグラウン ドなる用語は、 ペルォキシダーゼまたはそ の誘導体が存在しない場合の発光強度をいう。
    [0045] 本発明で用いるペルォキシターゼは特に限定されるも のではない力《、 好ま しく は西洋わさびペルォキシターゼ などの植物ペルォキシタ一ゼである。 ペルォキシターゼ 誘導体と しては、 例えばペルォキシターゼ抗体コンジゲ ー ト、 ペルォキシターゼ抗原コンジュゲー ト、 ペルォキ シターゼス ト レプトアビジンコンジュゲー トおよびピオ チン結合ペルォキシターゼを挙げることができる。 ここ で用いる抗体は特に制限はないが、 例えばィ ンタク ト I g G、 I g Mのほ力、にも F a b ' 、 F ( a b ) n などの 部分構造も好ま しく使用できる。 また、 抗原と しては特 に制限はなく 、 例えばフルォレ ツセン、 ステロイ ドホル モンのような低分子量ハプテンもポ リペプチ ド、 タ ンパ ク質、 多糖類のような高分子量物質も使用できる。
    [0046] 核酸ハイプリ ッ ド反応の場合には、 塩基数 1 0以上の D N Aおよび R N Aで直鎖でも環状でもよい。
    [0047] 酸化剤と しては、 好ま しく は過酸化水素が用いられる が、 過ホウ酸塩、 次亜塩素酸塩も使用できる。
    [0048] 本発明の実施に使用される化学発光性 D P Dは、 ルミ ノール、 イ ソルミ ノール、 N— （4一ア ミ ノ ブチル） 一 N—ェチルイ ソルミ ノ ールない し、 これらと結合した抗 原、 抗体、 核酸などであるが、 特にルミ ノールが好ま し い o
    [0049] 本発明でェンハンサ一と して用いる H H B Pは、 例え ば特開昭 5 0 — 4 6 6 6 6号に記載のとおり、 3—ァセ チルー 4 ー ヒ ドロキシクマ リ ンとハ。ラ ヒ ドロキシベンゾ アルデヒ ドを、 ア ミ ンの存在下に縮合させることにより 製造するこ とができる。
    [0050] 一般式
    [0051] 〔式中、 η は 1 〜
    [0052] 4の正の整数を表わす） 、 X C n H2n (こ こで、 Xは F C l 、 B r または Iを表わし、 nは前記定義に同じ） 、 C n H 2n+1C 09 ( nは前記定義に同じ） 、 C n H 2n+1 C 6 H4 ( nは前記定義に同じ） 、 フヱニル基、 ナフチ ル基、 Y C6 H4 (Yは F、 C l、 B r、 I またはフエ 二ル基を表わす） 、 XY C 6 H3 (X、 Yは前記定義に 同じ） を表わす〕
    [0053] で示されるォキサゾール誘導体の存在下に行なうことを 特徵とする高感度発光分析方法に関するものであり、 本 発明化合物 [ I ] の！ ェ は、 具体的には、 水素、 炭素数 1〜4のアルキル基と して、 メ チル基、 ェチル基、 プロ ピル基 （n—、 i s o—） 、 ブチル基 （n—、 i s o—、 s e c—、 t e r t —） 、 フヱニル基などが挙げられる。 ハロゲン化アルキル基と しては、 フルォロメ チル基、 ク ロロメチル基、 ブロモメ チル基、 ョー ドメ チル基、 1 一フルォロェチル基、 2—フルォロェチル基、 1一ク ロ 口ェチル基、 2—ク ロ口ェチル基、 1一ブロモェチル基、 2—ブロモェチル基、 1ーョー ドエチル基、 2—ョー ド ェチル基、 1一フルォロプロ ピル基、 2—フルォロプロ ピル基、 3—フルォロプロ ピル基、 1一フルオロー 1一 メ チルェチル基、 2—フルオロー 1—メチルェチル基、 1一ク ロ口プロ ピノレ基、 2—ク ロ口プロ ピル基、 3—ク ロロプロ ピル基、 1一ク ロロー 1一メ チルェチル基、 2 一ク ロロー 1一メ チルェチル基、 1—ブロモプロ ピル基、
    [0054] 2—ブロモプロ ピル基、 3—ブロ乇プロ ピル基、 1—ブ 口モー 1一メ チルェチル基、 2—ブロモー 1ーメ チルェ チル基、 1一ョー ドプロ ピル基、 2—ョー ドプロ ピル基、
    [0055] 3—ョー ドプロ ピル基、 1ーョ一 ドー 1一メ チルェチル 基、 2—ョ一 ドー 1一メチルェチル基、 1一フルォロブ チル基、 2—フルォロブチル基、 3—フルォロブチル基、 4一フルォロブチル基、 1一フルオロー 1 一メチルプロ ビル基、 2—フルオロー 1一メチルプロ ピル基、 3—フ ルオロー 1 一メチルプロピル基、 1 一フルォロメチルプ 口ビル基、 1 一フルオロー 2—メチルプロ ピル基、 2— フルオロー 2—メチルプロピル基、 3—フルオロー 2— メチルプロピル基、 1一フルォロメチルー 1 , 1 ージメ チルメチル基、 1 一クロロブチル基、 2—ク ロロブチル -、 基、 3—クロロブチル基、 4—クロロブチル基、 1 ーク ロロ一 1一メチルプロピル基、 2—ク ロロー 1 一メチル プロビル基、 3—クロロー 1一メチルプロ ビル基、 1一 クロロメチノレプロピル基、 1一クロロー. 2—メチルプロ ビル基、 2—クロロー 2—メチルプロ ビル基、 3—クロ 口— 2—メチルプロビル基、 1 一クロロメチルー 1 , 1 ージメチルメチル基、 1一ブロモブチル基、 2—ブロモ ブチル基、 3—プロモブチル基、 4一ブロモブチル基、 1 ーブロモー 1 一メチルプロピル基、 2—プロモー 1一 メチルプロピル基、 3—ブロモー 1一メチルプロ ピル基、 1一ブロモメチルプロピル基、 1 ーブロモー 2—メチル プロビル基、 2—プロモー 2—メチルプロ ピル基、 3— ブロモー 2—メチルプロピル基、 1 ーブロモメチルー 1 , 1一ジメチノレメチル基、 1 一ョー ドブチル基、 2—ョー ドブチル基、 3—ョー ドブチル基、 4一ョー ドブチル基、 1 ーョー ドー 1 一メチルプロ ビル基、 2—ョ一 ドー 1 — メチルプロ ピル基、 3—ョー ドー 1 一メチルプロ ピル基、 1ーョー ドメ チルプロ ピル基、 1 ーョー ドー 2—メ チノレ プロ ピル基、 2 —ョー ドー 2 —メ チルプロ ピル基、 3— ョ一 ドー 2 —メ チルプロ ピル基、 1 ー ョー ドメ チルー 1 , 1 ージメ チルメ チル基などが挙げられる。
    [0056] アルコキシカルボニル基と しては、 メ トキシカルボ二 ル基、 エ トキシカルボニル基、 プロポキシカルボニル基、 1 ーメ チルェ トキシカネボニル基、 ブ トキシカルポニル 基、 1 一メ チルプロポキシカルボニル基、. 2 —メ チルプ 口ポキシカノレポ'ニル基、 1 , 1 ージメ チノレエ トキシカノレ ボニル基などを挙げることができる。
    [0057] アルキル置換フヱニル基と しては、 2 —メ チルフエ二 ノレ基、 3 —メ チノレフエ二ノレ基、 4ーメ チノレフェニル基、 2—ェチノレフェニル基、 3—ェチノレフェニル基、 4ーェ チルフエニル基、 2 —プロ ピルフヱニル基、 3—プロ ピ ルフ ヱニル基、 4 一プロ ピルフ エニル基、 2 - ( 1 一 メ チルェチル） 基、 3— （ 1 ーメ チルェチル） 基、 4 一 ( 1 ーメ チルェチル） 基、 2 —ブチルフエニル基、 3— ブチルフ エニル基、 4 一ブチルフ エニル基、 2 - ( 1 - メ チルプロ ピル） フ エニル基、 3— （ 1 一メ チルプロ ピ ル） フヱニル基、 4一 （ 1 一メ チルプロ ピル） フエニル 基、 2— （ 2 —メチルプロ ピル） フ エニル基、 3— （ 2 一メチルプロ ピル） フエニル基、 4一 （2 —メ チルプロ ピル） フエニル基、 2— （ 1 , 1 ー ジメ チルェチル） フ ェニル基、 3— （ 1 , 1 ージメ チルェチル） フ エニル基、 4 一 （ 1 , 1 ージメ チルェチル） フエニル基などを挙げ ることができる。
    [0058] ハロゲン置換フエニル基と しては、 2—フルオロフェ ニル基、 3 —フルオロフェニル基、 4一フルオロフェニ ル基、 2—ク ロ口フエ二ル基、 3—ク ロ口フエ二ル基、 4一ク ロ口フエ二ノレ基、 2—ブロモフエニゾレ基、 3—ブ ロモフエニル基、 4一ブロモフエニル基、 2—ョー ドフ ェニル基、 3—ョー ドフエニル基、 4—ョー ドフエニル 基などを挙げることができる。
    [0059] 二置換フエニル基と しては、 2 , 4 —ジクロ口フエ二 ル基、 3 , 5—ジクロロフェニル基などを挙げることが できる。
    [0060] この中でも好ま しい置換基は、 水素、 メチル基、 フニ ニル基、 クロロメチル基、 エ トキシカルボニル基、 2 — メチルフヱニル基、 3—ブロモフエニル基、 4 一クロ口 フヱニル基、 2 , 4—ジク ロロフェニル基である。
    [0061] なお、 上記一般式 [ 1〕 の化合物のうち、
    [0062] 一般式
    [0063] 〔式中、 R 2 は X C H 2n (こ こで、 Xは F、 C 1 、
    [0064] B rまたは Iを表わし n .〜4の正の整数を表わす） n -2n+lC °2 (nは前記定義に同じ） 、 Cn H 2η, ,
    [0065] C EA ( nは前記定義に同じ） 、 ナフチル基、 Y Cハ (Yは F、 C l 、 B r、 I またはフエ二ル基を表わ す） 、 XYC6 H3 (X、 Yは前記定義に同じ） を表わ す〕
    [0066] で示されるォキサゾール誘導体は新規物質である。
    [0067] 本発明の化合物 [ I ] は、 下記の反応式 （ 1 ) により 合成できる。
    [0068] すなわち、
    [0069] RLC (OR3)3
    [0070]
    [0071] [i] [i]
    [0072] 〔式中、 は水素、 Cn H2n+: で、 nは 1〜
    [0073] 4の正の整数を表わす） 、 X Cn H2n こで、 Xは F、 C 1、 B rまたは Iを表わし、 nは前記定義に同じ） 、 Cn H2n+1C 02 ( n は前記定義に同 じ：） 、 フヱニル 基、 ナフチル基、 Cn H2n+1C6 H4 (nは前記定義に 同じ） 、 Y C6 H4 (Yは F、 C l 、 B r、 I またはフ ヱ二ル基を表わす） 、 XY C6 H3 (X、 Yは前記定義 に同じ） を表わし、 R3 は Cn H2n+1 (nは前記定義に 同じ） を表わし、 -Zは F、 C 1、 B rまたは Iを表わす〕 である。
    [0074] こ こで、 化合物 [m] で用いられる は、 具体的に は化合物 [ I ] で用いられる と同じものである。
    [0075] また、 R3 のアルキル基と しては、 メチル基、 ェチル 基、 プロ ピル基、 1一メ チルェチル基、 ブチル基、 "1 - メチルプロ ピル基、 2—メチルプロ ピル基、 1 , 1 —ジ メチルェチル基などを挙げることができる。
    [0076] 本発明で使用する塩基は、 炭酸水素ナ ト リ ゥム、 炭酸 水素カ リ ウム、 炭酸ナ ト リ ウム、 炭酸力 リ ゥムなどの炭 酸塩、 ト リ メチルァ ミ ン、 ト リェチルァ ミ ン、 t 一プチ ルァミ ンなどのア ミ ン類、 ピリ ジン、 キノ リ ンなどの芳 香族複素環化合物などであるが、 特に炭酸水素ナ ト リ ゥ ムが好ま しい。
    [0077] 反応は溶媒を必要とせず、 20〜 1 5 0てで進行する が、 目的物の収率を上げるためには 5 0〜 1 2 0てが好 ま しい。
    [0078] また、 ォキサゾール化合物 [ I ] のうち、 R , が X (：[1 11211 ( は？、 C l 、 B r または I を表わし、 n は 1〜 4の正の整数を表わす） の場合は、 下記の反応 式 （ 2 ) によっても、 また が Y C 6 H4 (Yは F、 C l、 B r、 I またはフエ二ル基を表わす） の場合は、 下記の反応式 （3) によっても製造できる。
    [0079] NH^Z" 、
    [0080] ίΝΤ ']
    [0081] 〔式中、 R3 は C n H2n+1 (nは 1〜4の正の整数を 表わす） を表わし、 Xおよび Zは F、 C 1 、 B r または Iを表わす〕
    [0082] この化合物 [IV] で用いられるハロゲン化アルキル基 は、 具体的には化合物 [ I ] で用いられるハロゲン化ァ ルキル基と同じものが用いられる。 また、 化合物 [IV] で用いられる R3 は、 具体的には化合物 [m] で用いら れる R3 と同じものが用いられる。
    [0083] 本発明で使用する反応溶媒は、 メ タノール、 エタノー ル、 プロノ、。ノール、 ブタノールなどのアルコール類、 ェ チルエーテル、 T H Fなどのエーテル類、 DMF、 DM S 0などの非プロ トン性極性溶媒などであるが、 特にェ 夕ノールが好ま しい。
    [0084] 反応は、 20〜 1 50でで進行するが、 目的物の収率 を上げるためには 60〜90°Cが好ま しい。
    [0085] 溶 媒
    [0086] [!"]
    [0087] 〔式中、 Yは F、 C l、 B r、 I またはフ エ二ル基を 表わし、 Zは F、 C l、 B rまたは Iを表わす〕
    [0088] 化合物 [V] で用いられる置換フニニル基は、 具体的 には化合物 [ I ] で用いられるハロゲン化フヱニル基、 フエニルフェニル基が用いられる。
    [0089] 第 1段の反応は、 溶媒を必要とせず 1 0 0〜 2 8 0 °C で進行するが、 化合物 [ VI ] の収率を上げるためには 1 5 0〜 2 5 0。Cが好ま しい。
    [0090] 化合物 [ VI ] の加水分解反応に使用する塩基は、 水酸 化ナ ト リ ウム、 水酸化力 リ ウム、 炭酸ナ ト リ ウムなどで あるが、 水酸化ナ ト リ ゥムが特に好ま しい。 溶媒と して は、 水、 メ タノール、 エタノールなどのアルコール類、 T H Fなどのエーテル類が使用できるが、 水ノメ タノー ルの混合溶媒が特に好ま しい。
    [0091] 加水分解反応は 2 0〜 5 0てで進行するが、 目的物の 収率を上げるためには 2 5〜 3 5でが好ま しい。
    [0092] 本発明のェンハンサ一は、 ペルォキシ夕ーゼ、 化学発 光性 D P D、 酸化剤からなる発光反応系を利用した物質 の測定法に用いることができる力く、 特にェンザィムィム ノアッセィ、 D N Aハイブリ ツ ド反応による測定に好ま しく用いられる。
    [0093] 以下、 実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。 実施例中の試薬および装置は次に示すものを用いた。 試 薬
    [0094] 4一ア ミ ノ レゾルシノール塩酸およびクロロアセ トニ ト リルはアル ドリ ツチ社 （A l dri ch Co . )力、ら、 エタノー ル、 D M S 0、 シユウ酸ジェチル、 3—ブロ ムべンゾィ ノレクロライ ド、 2—メチルベンゾイルク 口ライ ド、 4一 ク ロ口べンゾィノレク ロライ ド、 2 , 4—ジク ロ口べンゾ イルク 口ライ ド、 ノレミ ノール （5—ア ミ ノ ー 2, 3—ジ ヒ ドロー 1 , 4一フタラジンジオン） 、 およびイ ソルミ ノール （6—ア ミ ノ ー 2, 3—ジヒ ドロー 1 , 4一フタ ラジンジオン） は東京化成㈱から、 五塩化リ ンおよび炭 酸水素ナト リゥムは関東化学㈱から、 塩化水素ボンべは 鹤見曹達㈱から、 N— （4一アミノブチル） 一 N—ェチ ルイ ソルミ ノール （ A B E I ) およびト リ ス 〔ヒ ドロキ シメ チル〕 ァ ミ ノ メ タ ンはシグマ社 （Sigma Chemical Co.)から、 西洋わさびペルォキシターゼ （H R P) はべ 一リ ンガーマンノヽィム社 (Boehringer Mannheim Gnibh) から、 粉末 P B Sは日水製薬㈱から、 ゥシ血清アルブミ ン （B S A) は生化学工業㈱から、 2—ヒ ドロキシー 9 一フルォ レノ ンはァノレ ド リ ツ チケ ミ カル社 （Aldrich Chemical Co.) から、 それぞれ購入した。
    [0095] HH B Pは特開昭 50— 46666号公報に記載され た方法により調整した。
    [0096] 乳癌関連抗原 （ C A 1 5 — 3 ) 、 抗 C A 1 5— 3 抗体 （マウ スモノ ク ロ ーナル抗体） はセ ン ト コア社 (Malvern. USA) から入手した。 西洋わさびペルォキシ タ一ゼ標識抗 C A 1 5— 3抗体はマ レイ ミ ドヒ ンジ法
    [0097] [Yoshitake.S. et al ： J.Biochem. , 92, 1413-1424 (1982) 〕 により作成し、 ヒ ドロキシァハ。タイ トガラム (三井東圧、 H C A—力ラム、 07. 6議 X L l O Omni) を用いたフアルマシア社 F P L Cで分離精製した。 抗 C A 1 5— 3抗体固定化ポリスチレンビーズは、 直 径 6議のポリスチレンビーズ （明和フッ素商会、 面粗度 # 80) を l O yW g Zmlの抗 C A 1 5— 3抗体、 P B S 溶液中に一晩浸して作成した。
    [0098] 分折装置
    [0099] 化学発光反応は、 1 2顏 ø X 4 7 mmの 3 ml容の使い捨 てプラスチッ クチューブで行なった。 発生した光は、 Berthold社製、 ルミ ノメーター （Biolumat LB9500T) で 検出した。
    [0100] 赤外吸収スペク トル （以下、 I Rと略記） は、 日本分 光工業㈱製、 F TZ I R - 5000で測定した。
    [0101] 核磁気共鳴スぺク トル （以下、 NMRと略記） は、 日 本電子㈱製、 E X 9 0 F T NMRで測定した。
    [0102] 質量スぺク トル （以下、 M Sと略記） は、 直接導入法 により行ない、 日本電子㈱製、 J M S D 3 0 0質量分 析計で測定した。 また、 高分解能 M Sは、 J M S D X - 303質量分析計を用いて測定した。
    [0103] 実 施 例 1
    [0104] ルミ ノールと 2— ヒ ドロキシー 9一フルォレノ ンとを使 用するペルォキシダーゼの発光アツセィ
    [0105] 200〃i のルミ ノール （ l O O mM DM S O溶液 l O ^i X l O ml 0. 1 M— ト リ ス塩酸緩衝液 p H 7. 5 ) と の 2— ヒ ドロキシ一 9 一フルォ レノ ン （ l O O mM D M S O溶液 1 0 〃 J ノ 1 0 ml 0. 1 M— ト リ ス塩酸緩衝液 p H 7. 5 ) と の H R P 〔 1 1 1 1 unitZmgを 1 gr Zj の B S Aを含有す る P B S緩衝液 （p H 7. 4 ) で 1 0万倍に希釈〕 と 1 0 の過酸化水素 （9. 1 M水溶液を 1 0 0 0倍に 希釈） とをプラスチックキュベッ トに入れ、 3秒間ボル テックスミキサーで撹拌した後、 1 0秒後の発光強度を 測定した。 次に、 H R Pを含まない P B S緩衝液 （ρ Η 7. 4 ) 1 0 ίί とルミ ノール、 2 —ヒ ドロキシー 9一 フルォレノ ン、 過酸化水素を上記の量混合撹拌し、 1 0 秒後の発光強度を測定した。 前者と後者の比をシグナル Ζバックグラウン ド比 （ S Ν比） と して表 1に示す。 実 施 例 2
    [0106] 実施例 1の手順を反復し、 ノレ ミ ノ ールの代わりにイ ソ ルミノールを使用した。 結果は表 1に示す。
    [0107] 実施 例 3 - 実施例 1の手順を反復し、 ルミ ノールの代わりに Ν— (4 —ア ミ ノブチル） — Ν—ェチルイ ソルミ ノールを使 用した。 結果は表 1に示す。
    [0108] 比較例 1〜 3
    [0109] 実施例 1、 実施例 2、 実施例 3の手順に従い、 2 -ヒ ドロキシー 9 一フルォレノ ンを使用しなかった以外は全 く同様に操作した。 結果は表 1に示す。 t t |_4
    [0110] CD CJ1 CJ1 表 1 2, 3—ジヒ ドロー 1, 4一フタラジンジオン （DPD) による
    [0111] シグナル対バックグラウン ド比 （SN比）
    [0112] 10秒後の発光強度 （相対値）
    [0113] D P D S N 比
    [0114] + HR P -HR P 宾施冽 1 ル ミ ノ ー ノレ 449863 103 4368
    [0115] " 2 イ ソ ノレ ミ ノ ー ル 9885 99 99. 8
    [0116] N- (4一ア ミ ノブチル） 一 N—
    [0117] " 3 17370 96 180. 9 ェチノレイソノレミ ノーノレ 比蛟例 1 ル ミ ノ ー ル 149 133 1. 12
    [0118] " 2 イ ソ ノレ ミ ノ ー ル 167 1 54 1. 08
    [0119] N- (4ーァミ ノプチル） 一 N—
    [0120] " 3 1 57 137 1. 1 5 ェチルイソルミ ノール
    [0121] 実 施 例 4
    [0122] 2—ヒ ドロキシー 9一フルォレノ ンおよび各種ェンハン サ一を用いた C A 1 5— 3抗原の発光ァッセィ
    [0123] C A 1 5 — 3抗原溶液 （ 6 1 5 UZml) をゥ シ血清 アルブミ ンを含むリ ン酸塩緩衝液 （P B S ) で希釈し、 3 0 0 U/mK 2 0 0 U/mK 1 0 0 U/m 5 0 U/ mK 25 U/mK 0 U Zml (ゥシ血清アルブミ ンを含む P B S ) の濃度の溶液に調製し、 各々を標準 C A 1 5— 3溶液とした。
    [0124] 各濃度の標準 C A 1 5 - 3溶液を ずつ 2サン プルを ト レイ （2 5穴） に分注した。 ペルォキシダーゼ 標識抗 C A 1 5— 3抗体 （マウス） を 3 0 0 ずつゥ エルに加えた。 各ゥエルに抗体不溶化ビーズを w紙で付 着液を吸い取った後、 ピンセッ トで 1個ずつ加えた。
    [0125] ト レイカバーシールをし、 軽く たたいて混合した後、 2 5 °Cで 2時間反応させた。 反応終了後、 ビーズゥッ シ ヤーを用い、 生理食塩水 5mlで 3回洗浄した。 洗浄後、 ト レイ中のビーズを試験管に移し、 さ らにルミ ノ メータ 一測定用プラスチッ クキュべッ トに移動させた。
    [0126] 2 0 0 ί のルミ ノ ール （ l O O mM DM S O溶液 1 0 βίί / l O nil 0. 1 Μ— ト リ ス塩酸緩衝液 ρ Η 7. 5) と の 2 — ヒ ドロキシー 9 一フルォ レノ ン （ l O O mM D M S O溶液 Ι θ / l O ml 0. 1 M— ト リ ス塩酸緩衝液 p H 7. 5 ) と 1 0 ;ζΰ の 過酸化水素 （ 9. 1 Μ水溶液を 1 0 0 0倍希釈） とを各 々のプラスチッ クキュベッ トに加え、 5秒後および 1 0 秒後の発光強度を測定した。 結果を表 2 — 1、 表 2 — 2 に示した o
    [0127] 標準 C A 1 5 - 3抗原溶液 （3 0 0 U Zml、 2 0 0 U Zml、 1 0 0 U/mK 5 0 U/m 2 5 U Zml) の 5秒 後および 1 0秒後の発光強度と 0 U Zmlの 5秒後および 1 0秒後の発光強度の比 （S N比） をそれぞれ求め、 第 1図、 第 2図に示した。
    [0128] 比較例 4〜 8
    [0129] 実施例 4の手順を反復し、 2 — ヒ ドロキシー 9 一フル ォレノ ンの代わりに、 P —ョー ドフエノール、 P — ヒ ド ロキシゲイ皮酸、 P —フエニルフエノール、 6— ヒ ドロ キシベンゾチアゾール、 N , N , N ' , Ν' —テ トラメ チルべンジジンを使用した。 発光強度を表 2 — 1および 表 2— 2に、 S Ν比を第 1図および第 2図にそれぞれ示 す。
    [0130] t
    [0131] CD CJ1 C3 cn
    [0132] 表 2— 1 各種ェンハンサーを添加した場合の 5秒後の発光強度 （相対値）
    [0133] C A 15-3 (U/ml)
    [0134] ェ ン ハ ン サ ー
    [0135] U ou 1 1 nUn nn
    [0136] U UU oUU mm 4 P—ョー ドフエノール 1686 10314 28463 67438 142810 238017
    [0137] " 5 P—ヒ ドロキシケィ皮酸 1745 4661 7736 10314 17851 28246
    [0138] " 6 P—フヱニルフエノール 590 7023 10525 21541 31672 49180
    [0139] " 7 6—ヒ ドロキシベンゾチアゾール 912 3471 6843 9719 15868 22810
    [0140] N, N, Ν' , Ν' ーテトラメチル
    [0141] " 8 203 99 174 298 1785 3968
    [0142] ベンジジン
    [0143] ¾施例 4 2—ヒ ドロキシ一 9一フルォレノ ン 472 13554 24492 41803 64033 116066
    [0144] t t
    [0145] 3 表 2 - 2 各種ェンハンサーを添加した場合の 10秒後の発光強度 （相対値）
    [0146] CA 15-3 (U/ml)
    [0147] ェ ン ノヽ ン サ 一
    [0148] 0 25 50 100 200 300 比較例 4 P—ョードフエノール 1796 12664 38123 85089 153034 242580
    [0149] " 5 P—ヒ ドロキンゲイ皮酸 1630 4670 7663 10363 15525 27940
    [0150] t
    [0151] CO
    [0152] " 6 P—プヱニルフヱノール 675 7003 10487 21288 35650 52421
    [0153] " 7 6—ヒ ドロキシベンゾチアゾール 811 3438 6819 9696 18092 22644
    [0154] N, N, Ν' , N' —テトラメチル
    [0155] " 8 423 84 354 290 3127 6900
    [0156] ベンジジン 突施冽 4 2—ヒ ドロキン一 9一フルォレノン 643 13652 24248 40907 63885 116905
    [0157] 実施 例 5
    [0158] ルミ ノールと HH B Pとを使 するペルォキシダーゼの 発光ァッセィ
    [0159] 2 0 0 ^5 のルミ ノール （ l O O mM DM S O溶液
    [0160] 0. 1 M— ト リ ス塩酸緩衝液 p H 8. 5) と 20 0 J の H H B P ( 1 0 0 mM DM S 0溶液 1 O /t i Z l OmlO O. 1 M— ト リ ス塩酸緩衝液 p H 8. 5) と 1 0 £ の西洋わさびペルォキシダーゼ (H R P ) 〔 1 1 1 を 1 £ の83八を含 有する P B S緩衝液 （p H 7. 0) で 1 0万倍に希釈〕 と 1 0 の過酸化水素 （9. 1 Μ水溶液を 1 0 0 0倍 に希釈） とをプラスチックチューブに入れ、 3秒間ボル テックスミキサーで撹拌した後、 1分後の発光強度を測 定した。
    [0161] 次に、 HR Pを含まない P B S緩衝液 （ρ Η 7. 0 ) 1 0 & とルミ ノール、 ΗΗ Β Ρ過酸化水素を上記の量 混合撹拌し、 1分後の発光強度を測定した。 前者と後者 の比をシグナル Ζバックグラウンド比 （S N比） として 表 3に示した。
    [0162] 実施例 6、 7
    [0163] 実施例 6、 7として、 実施例 5のルミ ノールの代わり にイソルミノール （実施例 6) 、 または Α Β Ε I (実施 例 7) を用いる以外は実施例 5と同様にして発光強度を 測定し、 表 3に示した。 比較例 9〜 1 1
    [0164] 実施例 5〜 7の H H B Pを使用しなかった以外は全く 同様にして発光強度を測定し、 表 3に示した。
    [0165] 実施例 5〜 7および比較例 9〜 1 1から、 本発明が優 れた発光分析方法であることが明らかとなつた。
    [0166] t 卜
    [0167] CD JI 表: 3 2 , 3—ジヒ ドロ一 1 , 4一フタラジンジ才ン （D P D)
    [0168] による シグナル対バックグラウ ン ド比 （S N比）
    [0169] 1分後の発光強度 （相対値）
    [0170] D P D
    [0171] + H R P - H R P S N 比
    [0172] 5 ル ミ ノ ー ル 453039 88 5148
    [0173] " 6 イ ソルミ ノ ール 7524 24 313. 5
    [0174] t
    [0175] " 7 A B E I 21073 31 679. 8 比蛟冽 ル ミ ノ ー ル 550 507 1. 08
    [0176] 〃 1 0 イ ソル ミ ノ ール 1 60 1 37 1. 1 7 1 1 A B E I 188 180 1. 04
    [0177] 実 施 例 8
    [0178] 6—ヒ ドロキシベンゾォキサゾールの合成
    [0179] 4一ア ミ ノ レゾルシノール塩酸塩 2. 0 g- ( 1 2. 4 minol) 、 オルトギ酸メチル 8. 5 ml ( 5 1. 4 ιπιποΐ) 、 炭酸水素ナ ト リ ウム 1. 0 7 g ( 1 2. διπιποΐ) を冷却 用コンデンサーを付けたニッロフラスコに入れ、 ァルゴ ン雰囲気下 1 00てで一昼夜撹拌した。 反応終了後、 反 応液で冷却してへキサンを加え生成物を14過した。 結晶 を水洗して無機塩を除き、 再度14過した。
    [0180] 得られた結晶をァセ ト ンに溶解し、 活性炭を加え、 1. 5時間加熱還流した。 活性炭を除き、 アセ ト ンをェ バポレーターにて濃縮し、 得られた結晶でアセ ト ン一水 で再結晶した。 白色粉末 0. 28 g (2. 07ιπιπο1) を 得、 反応率は 1 6. 7 %であった。
    [0181] m. ρ . ： 183. 5〜： L 85 · 2で
    [0182] I R ( K B r、 cm 17 ) ：
    [0183] 3150、 1630、 1528、 1489、 1276、 1236、 1195、 1104、 1085、 816
    [0184] NMR ( 5、 DM S 0 - ） ：
    [0185] . 6.81 (dd, 1H) 、 7.03 ( d , 1H) 、 7.53 ( d , 1H) 、
    [0186] 8.46 ( s , 1H) 、 9.75 ( s , 1H)
    [0187] M S (E I ) : 1 35 (M + ) 、 52、 3 1
    [0188] 高分解能 M S (E I ) ： C H 5 02 N
    [0189] 計算値 1 3 5. 0344
    [0190] 実測値 1 3 5. 033 2 ルミ ノールと 6ーヒ ドロキシベンゾォキサゾールと使 ¾ するペルォキシターゼの発光ァッセィ
    [0191] 200 ^5 のルミ ノール溶液 （l O O mM DMS O 溶液 1 0 / 1 Oml、 0. 1 M— ト リス塩酸塩緩衝液 p H 8. 5) と 200 £ の 6—ヒ ドロキシベンゾォキ サゾール溶液 （ l O O mM DM S 0溶液 1 0
    [0192] 1 0ml、 0. 1 M— ト リス塩酸塩緩衝液 p H 8. 5) と 10 ίϋ の西洋わさびペルォキシターゼ （HR Ρ) 溶液 〔1 1 1 1 unitZmgを 1 g /j の B S Aを含有する P B S緩衝液 （p H 7. 0 ) で 1万倍に希釈〕 と 1 0 £ の 過酸化水素溶液 （9. 1 M水溶液を 1 000倍に希釈） とをプラスチックキュベッ トに入れ、 3秒間ボルテック スミキサーで撹拌した後、 1分後の発光強度を測定した。
    [0193] 次に、 H R Pを含まない P B S緩衝液 （p H 7. 0) 1 0 とルミ ノール、 6—ヒ ドロキシベンゾォキサゾ ール、 過酸化水素を上記量混合撹拌し、 1分後の発光強 度で測定した。 前者と後者の比を、 シグナル Ζ.バックグ ラウン ド比 （S Ν比） として表 4に示した。
    [0194] 実施例 9、 1 0
    [0195] 実施例 9、 1 0として、 実施例 8の発光ァッセィにお いてルミ ノールの代わりにイソルミ ノール （実施例 9 ) 、 Ν - (4ーァ ミノブチル） 一 Ν—ェチルイソルミ ノール (以下、 A B E I と略す） （実施例 1 0) を用いる以外 は、 実施例 8と同様にして発光強度を測定し、 表 4に示 した。 実施例 1 1
    [0196] 実施例 8の 6—ヒ ドロキシベンゾォキサゾールの代わ りに 2 —メチルー 6 — ヒ ドロキシベンゾォキサゾールを 用いる以外は、 実施例 8と同様にして発光強度を測定し、 表 4に示した。
    [0197] 実施例 1 2、 1 3
    [0198] 実施例 1 2、 1 3と して、 実施例 1 1のルミ ノールの 代わりにイソルミ ノール （実施例 1 2 ) 、 A B E I (実 施例 1 3 ) を用いる以外は、 実施例 1 1 と同様にして発 光強度を測定し、 表 4に示した。
    [0199] 実施例 1 4
    [0200] 実施例 8の 6— ヒ ドロキシベンゾォキサゾールの代わ りに 2 —フエ二ルー 6 —ヒ ドロキシベンゾォキサゾール を用いる以外は、 実施例 8と同様にして発光強度を測定 し、 表 4に示した。
    [0201] 実施例 1 5、 1 6
    [0202] 実施例 1 5、 1 6と して、 実施例 1 4のルミ ノールの 代わりにイ ソルミ ノール （実施例 1 5 ) 、 A B E I (実 施例 1 6 ) を用いる以外は、 実施例 1 4と同様にして発 光強度を測定し、 表 5に示した。
    [0203] 比較例 1 2〜： L 4
    [0204] 比較例 1 2 〜 1 4 と して、 実施例 8〜 1 0の 6 — ヒ ド ロキシベンゾォキサゾールを使用しない以外は、 全く 同 様にして発光強度を測定し、 表 4に示した。 t t
    [0205] CJ1 en CZ5 CJ1 表 4 ェンハンサ一と 2, 3—ジ ΐ:ドロ一 1 , 4一フタラジンジオン
    [0206] の組合せによるシグナノレ対バックグラウンド比
    [0207] CO
    [0208] 3
    [0209] 実施例 1 7
    [0210] H H B Pを用いた C A 1 5 - 3抗原の発光ァッセィ
    [0211] C A 1 5 — 3抗原溶液 （ 6 1 5 U Zml ) をゥ シ血清 アルブミ ンを含むリ ン酸塩緩衝液 （P B S ) で希釈し、 3 0 0 U /mK 2 0 0 U /mK 1 0 0 U /mK 5 0 U / ml、 2 5 U /mK 0 U /ml (ゥシ血清アルブミ ンを含む P B S ) の濃度の溶液に調製し、 各々を標準 C A 1 5 - 3溶液と した。
    [0212] 各濃度の標準 C A 1 5 — 3溶液 2 0 ΰ ずつ 2サンプ ルを ト レイ （ 2 5穴） に分注した。 ペル才キシダーゼ標 識抗 C A 1 5 — 3抗体 （マウス） を 3 0 0 ^ ί ずつゥェ ルに加えた。 各ゥエルに抗体不溶化ビーズを14紙で付着 液を吸い取った後、 ピンセッ トで各ゥヱルに 1個ずつ加 えた。
    [0213] ト レイカバーシールを貼り、 軽く たたいて混合した後、 2 5 eCで 2時間反応させた。 反応終了後、 ビーズゥ ッ シ ヤ ーを用い、 生理食塩水 5 mlで 3回洗浄した。 洗浄後、 ト レイ中のビーズを試験管に移し、 さ らにルミ ノメータ 一測定用プラスチックチューブに移動させた。
    [0214] のル ミ ノーノレ （ l O O m M D M S 0溶液
    [0215] 1 0 i £ / 1 0 ml 0. 1 M— ト リ ス塩酸緩衝液 p H 7. 5 ) と 2 0 0 j の H H B P ( l O O m M D M S 0溶液 1 0 1 0 ml 0. 1 M— ト リ ス塩酸緩衝液 p H 7. 5 ) と 1 0 ζ ί の過酸化水素 （ 9. 1 M水溶液 を 1 0 0 0倍に希釈） とを各々のプラスチッ クチューブ に加え、 1 0秒後の発光強度を測定した。 2サンプルの 平均発光強度を表 5に示した。
    [0216] 標準 C A 15 - 3抗原溶液 （300 UZml、 200 U Zml、 100 U/m 50 U/mU 25 U/ml) の 10 秒後の平均発光強度と 0 UZmlの 10秒後の平均発光強 度の比 （S N比） を求め、 第 3図に示した。
    [0217] 実施例 18
    [0218] 2—メチルー 6—ヒ ドロキシベンゾォキサゾールを用い た C A 1 5 - 3抗原の発光ァッセィ
    [0219] 実施例 17の H H B Pの代わり に 2—メ チルー 6—ヒ ドロキシベンゾォキサゾールを使用した以外は、 実施例
    [0220] 17と同様に操作し発光強度を測定し、 平均発光強度を 表 5に、 S N比を第 3図に示した。
    [0221] 比較例 1 5 - 実施例 17の手順に従い、 HH B Pおよび 2—メチル 一 6—ヒ ドロキシベンゾォキサゾールを使用しなかつた 以外は、 全く同様に測定を行なった。 平均発光強度を表 5に、 S N比を第 3図に示した。
    [0222] t t
    [0223] CD CJ
    [0224] 表 5 CA 15— 3の分析 10秒後の平均発光強度 （相対値）
    [0225] CA 15-3 (U/ml)
    [0226] ェ ン ノヽ ンサ一
    [0227] 0 25 50 100 200 300
    [0228] 実施例 17 H H B P 602 8031 17045 30454 65824 91745
    [0229] 2—メチルー 6—ヒドロ
    [0230] 実施例 18 401 3370 6929 17223 27926 46613
    [0231] キンべンゾォキサゾール
    [0232] 比較冽 15 な し 154 148 165 165 152 182
    [0233] 実施例 1 9
    [0234] 2—ク口ロメチル一 6—ヒ ドロキシベンゾォキサゾール の合成
    [0235] 撹拌羽根を付けた 3 0 0 ml三ッロフラスコに、 クロ口 ァセ トニ ト リル 2 6. 1 g ( 34 5. 7 πιιποΐ) 、 無水ェ 夕ノール 2 0 ml、 エーテル 7 0 mlを入れ、 ゆっ く りと撹 拌しながら、 室温で約 4 0分間塩化水素ガスを吹き込ん だ。 生成した白色沈殿を14過し、 エーテルで洗浄した。
    [0236] 3 7. 5 g ( 2 3 7. 3 mol)のクロロメチルイ ミ ド酸ェ チル塩酸塩が得られ、 反応収率は 6 8. 7 %であった。
    [0237] 上述のクロロメチルイ ミ ド酸ェチル塩酸塩 1. 7 8 g ( 1 1. 3 Dnol) 、 4一ア ミ ノ レゾルシノール塩酸塩 1. 2 2 g (7. 5 5ιπιηο1) 、 エタノール 2 O mlをジム ロー トコンデンサーを付けたニッロフラスコに入れ、 ァ ルゴン雰囲気下、 一昼夜加熱還流した。 反応終了後、 冷 却して結晶を14過し、 へキサンで洗浄した後、 目的物を 減圧乾燥した。 0. 4 0 gr ( 2. 3 3 ιππιο1) の 2—クロ ロメチルー 6—ヒ ドロキシベンゾォキサゾールが得られ、 反応収率は 3 0. 9 %であった。
    [0238] m. p . : 14 8. 5〜 1 5 3. 7。C
    [0239] I R (第 4図、 K B r、 cm ） ：
    [0240] 3076、 1615、 1572s 1491、 1334、 1238、 1141、 837 NMR (第 5図、 D M S 0— d ） ：
    [0241] 4.97 ( s , 2Η) 、 6.84 (dd, 2Η) 、 7.08 ( d , 1H) . 7.55 ( d , 1H) 、 9.89 ( s , 1H) MS (E I ) : 1 83 (M + ) 、 148
    [0242] 高分解能 M S (E I ) ： C g H6 02 N C 1
    [0243] 計算値 1 83. 00 1 5
    [0244] 実測値 1 83. 00 5 1
    [0245] 実施例 20
    [0246] 2—エ トキシカルボ二ルー 6— ヒ ドロキシベンゾォキサ ゾールの合成
    [0247] 撹拌羽根、 冷却用コンデンサーを付けた 50 0ml三ッ 口フラスコに、 6 1. 3 g (420 niinol) のシユウ酸ジ ェチルと 90. 2 g (433ιηιπο1) の五塩化リ ンを入れ、 1 05°Cで 1 7時間加熱撹拌した。
    [0248] 残った液体を 1 1 mmHgの減圧化、 蒸留し、 7 7〜85 。Cの留分 53. 2 g (26 5 nnnol) を集めた。 ジクロロ エ トキシ酢酸ェチルの生成収率は、 63. 0 %であった。
    [0249] 撹拌羽根、 冷却用コンデンサ一、 滴下 b— トを付けた 500 ml三ッロフラスコに、 無水エーテル 85 ml、 無水 エタノ ーノレ 3 5. 5 ml、 ジク ロ ロエ トキ シ酢酸ェチル 53. 2 g (26 5πιπιο1) をアルゴン雰囲気下入れ、 撹 拌しながら滴下ロー トから無水ピリ ジン 4 9. 5 mlを 1 時間で滴下した。
    [0250] 2時間室温で撹拌した後、 ビリ ジン塩酸塩を14過で除 き、 50 mlの無水エーテルで洗浄した。 14液からエーテ ルを留去し、 残った液体を 9 CTCで 1時間半撹拌した。 反応液を冷却し、 エーテルを加え、 3 N—硫酸、 炭酸 水素ナ ト リ ゥム水溶液で順次洗浄した。 エーテル層を 硫酸マグネ シウムで乾燥した後、 エーテルを留去し、 残液を 7 mmHgの減圧下、 蒸留した.。 83〜89 °Cの留分 40. 1 g ( 182πιπιο1) を集めた。 生成したト リエト キシ酢酸ェチルの収率は、 68. 7 %であった。
    [0251] 上述の ト リエトキシ酢酸ェチル 4 ml、 4ーァミ ノ レン ゾルシノ ール塩酸塩 1. 00 g (6. 1 9 O1) 、 炭酸 水素ナト リ ウム 5. 0 5 mgを冷却用コ ンデセンサーを付 けたニッロフラスコにアルゴン雰囲気下入れ、 1 0 CTC で一昼夜加熱撹拌した。
    [0252] 反応液を冷却して沈殿を生成させ、 14過した。 沈殿は アセ ト ンに溶解し、 活性炭を加え、 1. 5時間加熱還流 した。 活性炭を14過で除き、 14液はシリカゲルカラムを 通し、 濃縮した。 生成した結晶を減圧乾燥して、 2— ェ トキシカノレポ二ルー 6— ビ ドロキシベンゾォキシサ ゾール 1. 07 g (5. 1 7 niDiol) を得た。 反応収率は 83. 5 %であった。
    [0253] m. p. : 1 9. 5〜200. 2。C
    [0254] I R (第 6図、 K B r、 cm 17) ：
    [0255] 3278s 1736、 1630、 1539、 1489、 1261、 12"、 1145、 116、 849、
    [0256] NMR (第 7図、 DMS 0— d。 ） ：
    [0257] 1.35 ( t , 3H) . 4.41 ( q , 2H) 、 6.97 (dd, 1Η·) 、 7.14 ( d , 1H) 、 7.72 ( d , III) 、 10.25(bs, iH)
    [0258] MS (E I ) : 207 (M + ) 3 5 高分解能 M S (E I ) ： C 10H 9 04 N
    [0259] 計算値 20 7. 0 5 9 1
    [0260] 実測値 2 0 7. 0 5 6 1
    [0261] 実施例 2 1
    [0262] 2 - (3—ブロモフエニル） 一 6—ヒ ドロキシベンゾォ キサゾールの合成
    [0263] 温度計および冷却用コンデンサーを付けた三ッロフラ ス コ に、 3 —ブロ モ安息香酸ク ロラ イ ド 1 4. 1 ml ( 1 0 7 ιπιποΐ) と 4 一ア ミ ノ レゾルシノ ール塩酸塩 1. 7 g ( 1 0. 5 nimol) を入れ、 9 0〜 1 4 5でに 3 0分加熱した。 残渣に水酸化ナ ト リ ゥム水溶液とメ タノールを加え、 均一溶液と して 2時間室温で撹拌し た。 反応液を酢酸ェチルで 2回抽出し、 I N *塩酸、 飽 和食塩水の順で洗浄した。 過剰の酢酸ェチルを留去し、 得られた沈殿を T H F Z水で再結晶した。 0. 6 8 g ( 2. 3 5 Diinol) の 2— （3—プロモフヱニル） 一 6— ヒ ドロキシベンゾォキサゾールが得られ、 反応収率は 1 6. 6 %であった。
    [0264] m. p . : 248. 0〜 24 8. 5 V
    [0265] I R (第8図、 8 1"、 cm 17 ) ：
    [0266] 3190、 1630、 1549、 1475、 1325、 1234、 1143、 1062、 835、
    [0267] NMR (第 9図、 DM S 0— d 6 ) ：
    [0268] 6.90 (dd, 1H) 、 7.12 ( d , 丄 H) 、 7.66 ( m , 2Η) 、 7.71 ( d , 1Η) 、 8.15 ( in , 2H) 、 9.94 ( s , 1H) MS (E I ) : 289 (M + ) 、 29 1 (M+ + 2) 、
    [0269] 2 1 0、 182.
    [0270] 高分解能 MS (E I ) ： C 13H 8 02 N B r
    [0271] 計算値 288. 9738
    [0272] 実測値 288. 97 1 1
    [0273] 実施例 22
    [0274] 2 — ( 2—メチルフエニル） 一 6—ヒ ドロキシベンゾォ キサゾールの合成
    [0275] 温度計および冷却用 コ ンデンサーを付けた三ッ ロ フ ラ ス コ に、 2 —メ チル安息香酸ク ロライ ド 1 4 ml ( 1 07. 3πιπιο1) と 4 -ア ミ ノ レゾルシノール塩酸塩 1. 7 g (10. 5 ιππιοΐ) を入れ、 144〜 2 1 5でで 1時間加熱した。 過剰の酸ク ロライ ドを蒸留で除き、 系を 1〜 1. 5 mroHgの減圧にして 88〜 230での留分 6. 2 gを集めた。
    [0276] 上述の留分にェタールを加え再結晶し、 結晶 2. 32 g ( 6. 7 6 ιπιποΐ) を得た。 結晶 5 0 0 mg ( 1. 46 Diniol) に、 K 0 H 7 7 2 mg; ( 1 3. 6 nimol) 、 T H F
    [0277] 30 mK 水 5ml、 メ タノール 1 0 mlを加え、 室温で一昼 夜撹拌した。 反応液を酢酸ェチルで抽出し、 飽和食塩水 で洗浄した後、 過剰の酢酸ェチルを留去した。 残渣を真 空ポンプで乾燥し、 2— （2—メ チルフエニル） 一 6— ヒ ドロキシベンゾォキサゾール 320 mg ( 1. 4 2 πιιποΐ) を得た。 反応収率は 62. 7 %であった。
    [0278] m. p. : 1 33. 5〜： L 37. 5 °C I R (第 1 0図、 K B r、 cm 17) ：
    [0279] 3064、 1613、 1489、 1224、 1151、 729
    [0280] N M R (第 1 1図、 D M S O d β )) ：
    [0281] 2.73 ( s , 3H) 、 6.87 (dd, 1Η) 、 7.11 ( d 1H) 7.42 ( m , 3H) 、 7.64 ( d , 1H) 、 8.06 ( oi 1H) 9.86 ( s , 1H)
    [0282] M S ( E I ) : 2 2 5 (M + ) 1 9 6、 1 6 8、
    [0283] 1 5 6 6 9 1、 7 9、 5 1 3 9
    [0284] 高分解能 M S ( E I )
    [0285] C 14H11° 2 N
    [0286] 計算値 2 2 5 0 7 9 0
    [0287] 実測値 2 2 5 0 7 64
    [0288] 実施例 2 3
    [0289] ルミ ノールと 2—エ トキシカルボ ノレ一 6— ヒ ドロキシ ベンゾォキサゾールと使用するペルォキシターゼの発光 ッセっ
    [0290] 2 0 0 z ϋ のルミ ノール溶液 （ l O O m M D S O 溶液 1 0 〃 i Z 1 0 ml、 0. 1 M— ト リ ス塩酸塩緩衝 液 p H 8. 5 ) と実施例 3で得られた 2 0 0 の 2 一エ トキシカルボ二ルー 6— ヒ ドロキシベンゾォキサ ゾール溶液 （ 1 0 0 m M D M S 0溶液 1 0 ノ 1 0 ml、 0. 1 M— ト リス塩酸塩緩衝液 p H 8. 5 ) と 1 0 β & の西洋わさびペルォキシターゼ H R Ρ ) 溶液 〔 1 1 1 1111111 1^を 1 g Zj の B S Aを含有する P B S緩衝液 （ p H 7. 0 ) で 1万倍に希釈〕 と 1 0 i の 過酸化水素溶液 （9. 1 M水溶液を 1 0 0 0倍に希釈） とをプラスチックキュベッ トに入れ、 3秒間ボルテック スミキサーで撹拌した後、 1分後の発光強度を測定した, 次に、 H R Pを含まない P B S緩衝液 （p H 7. 0) 1 0 βί とノレミ ノール、 2—エ トキシカルボ二ルー 6— ヒ ドロキンべンゾォキサゾールを上記量混合撹拌し、 1 分後の発光強度で測定した。 前者と後者の比を、 シグナ ル Ζバックグラウン ド比 （S Ν比） と して表 6に示した, 実施例 24、 2 5
    [0291] 実施例 24、 2 5と して、 実施例 2 3のルミ ノールの 代わりにイソルミ ノール （実施例 24 ) 、 Ν— （4ーァ ミ ノブチル） 一 Ν—ェチルイソルミ ノール （以下、 A B E I と略す） （実施例 2 5 ) を用いる以外は、 実施例 23と同様にして発光強度を測定し、 表 6に示した。
    [0292] 実施例 2 6
    [0293] 2— （3—ブロモフエニル） 一 6—ヒ ドロキシベンゾォ キサゾ一ルを用いたペルォナシ _ーゼの発光ァッセィ
    [0294] 実施例 2 3の 2—ェトキシカルボ二ルー 6—ヒ ドロキ シベンゾォキサゾールの代わりに、 実施例 2 1で得られ た 2— （3—ブロモフヱニル） 一 6—ヒ ドロキシベンゾ ォキサゾールを用いる以外は、 実施例 2 3と同様にして 発光強度を測定し、 表 6に示した。
    [0295] 実施例 2 7. 28
    [0296] 実施例 2 7、 28と して、 実施例 2 6のルミ ノールの 代わり にイ ソルミ ノ ール （実施例 2 7 ) 、 A B E I (実 施例 28) を用いる以外は、 実施例 26と同様にして発 光強度を測定し、 表 6に示した。
    [0297] 実施例 2 9
    [0298] 実施例 23の 2—エトキン力ルボニル一 6— ヒ ドロキ シベンゾォキサゾールの代わりに、 実施^ 1 9で得られ た 2—ク口ロメチノレー 6— ヒ ドロキシベンゾォキサゾー ルを用いる以外は、 実施例 2 3と同様にして発光強度を 測定し、 表 6に示した。
    [0299] 実施^ 30、 3 1
    [0300] 実施例 30、 3 1と して、 実施例 29のルミ ノールの 代わりにイソルミ ノール （実施例 30 ) 、 A B E I (実 施例 3 1 ) を用いる以外は、 実施例 29と同様にして発 光強度を測定し、 表 6に示した。
    [0301] 実施例 32
    [0302] 実施例 20の 2—エ トキン—カルボ二ルー 6— ヒ ドロキ シベンゾォキサゾールの代わりに、 実施例 22で得られ た 2— （2—メチルフエニル） 一 6— ヒ ドロキシベンゾ ォキサゾールを用いる以外は、 実施例, 23と同様にして 発光強度を測定し、 表 6に示した。
    [0303] 実施例 33. 34
    [0304] 実施例 33、 34と して、 実施例 3 2のルミ ノールの 代わりにイソルミ ノール （実施例 33) 、 A B E I (実 施例 34 ) を用いる以外は、 実施例 32と同様にして発 光強度を測定し、 表 6に示した。 比較例 16〜： L 8
    [0305] 比較例 16〜 18として、 実施例 23〜 25の 2—ェ トキシカルボ二ルー 6—ヒ ドロキシベンゾォキサゾール を使用しない以外は、 全く同様にして発光強度を測定し、 表 6に示した。
    [0306] ISD t
    [0307] n
    [0308] en CD 表 6 ェンハンサ一と 2, 3—ジヒ ドロ一 1, 4—フタラジンジオン （DPD)
    [0309] の組合せによるシグナル対バックグラウンド比 （S N比）
    [0310] CO
    [0311]
    [0312] * HRPを 10倍希釈して得られた発光強度を 10倍した値
    [0313] n 表 6 (続き）
    [0314]
    [0315] * 111 を10倍希釈して得られた発光強度を 10倍した値
    [0316] 実施例 35
    [0317] 2 - (3—クロロフヱニル） 一 6—ヒ ドロキンべンゾォ キサゾ一ルの
    [0318] 温度計および冷却用コ ンデ ンサーを付けた三 ッ 口 フ ラ ス コ に、 3 — ク ロ 口安息香酸ク ロラ イ ド 4. 5 ml (35. 2 iDfflOl) と 4一アミ ノ レゾルシノール塩酸塩 1. 0 g (6. 1 ηιιο1) を入れ、 1 7 0〜 23 5。Cで 1時間加熱した後、 過剰の酸クロライ ドを蒸留で除いた。 残澄に、 N a 0 H 1. 5 s ( 3 7. 5 mniol) 、 T H F 20 mU 水 20 ml、 メタノール 1 0 mlを加え、 室温で約 2時間撹拌した。 反応液を酢酸ェチルで抽出し、 飽和食 塩水で洗浄した後、 過剰の酢酸ェチルを留去した。 残渣 を水 メ タノール ZTH Fで再結晶した後、 結晶を乾燥 し、 2— （3—ク ロロフヱニル） 一 6—ヒ ドロキシベン ゾォキサゾール 2 50 mg ( 1： 02 mmol) を得た。 反応 収率は 1 6. 5%であった。
    [0319] m. p. : 246. 0〜 247. 5 °C
    [0320] I R (第 1 2図、 K B r、 cm 17) ：
    [0321] 3146、 1630、 1599、 1551、 1477、 1328、 1232、 1145、 1062、 835
    [0322] NMR (第 1 3図、 DM S O— d 6 ) ：
    [0323] 6.90 (dd, 1H) 、 7,12 ( d , 1H) 、 7.61 m , 3H) 、 8.06 "， 2H) 、 9.94 ( s , 1H)
    [0324] M S (E I ) : 24 5 (M + ) 、 24 7 (M+ + 2) 、
    [0325] 1 38、 1 22、 80、 5 2 高分解能 M S ( E I ) ： C i3H 8 02 N C 1
    [0326] 計算値 24 5. 0 1 9 3
    [0327] 実測値 24 5. 0 2 1 8
    [0328] 実施例 3 6
    [0329] 2 — （4一クロ口フ エニル） 一 6—ヒ ドロキシベンゾォ キサゾールの合成
    [0330] 温度計および冷却用コ ンデンサーを付けた三ッ ロ フ ラ ス コ に、 4 — ク ロ 口安息香酸ク ロ ラ イ ド 2 5 g ( 1 4 2 , 8fflDiol) と 4一アミノ レゾルシノール塩酸塩 3. 0 g ( 1 8. 6 nifflol) を入れ、 1 7 0〜2 0 0。Cで 1時間加熱した後、 過剰の酸クロライ ドを蒸留で除いた。 残渣に、 N a O H 8. 4 g ( 2 1 O mnol) 、 T H F 6 0 ml、 水 6 0 ml、 メタノール 3 0 mlを加え、 室温で約 2時 間撹拌した。 反応液を酢酸ェチルで抽出し、 飽和食塩水 で洗浄した後、 過剰の酢酸ェチルを留去した。 残渣を水 Zメ タノール ZT H Fで再結晶した後、 結晶を乾燥し、 2 — （ 4一ク ロ口フエ二ノレ） 一 6—ヒ ドロキシベンゾォ キサゾール 1. 24 g ( 5. 0 5 ramol) を得た。 反応収 率は 2 7. 2 %であつた。
    [0331] m. p . : 2 7 2. 8〜2 7 3. 5 °C
    [0332] I R (第 1 4図、 K B r、 cm 17 ) ：
    [0333] 3138、 1632、 1618、 1485. 1236、 1143、 832
    [0334] N MR (第 1 5図、 D M S O - d 6 ) ：
    [0335] 6.87 (dd， 1H) 、 7.11 ( d , 1H) 、 7.62 ( m , 3H) 、 8.13 ( d , 2H) 、 9.90 ( s， 1H) M S (E I ) : 24 5 (M + ) 、 24 7 (M + + 2) 、
    [0336] 1 38、 1 22
    [0337] 高分解能 M S (E I ) ： C13Hg 02 N C 1
    [0338] 計算値 24 5. 0 1 78
    [0339] 実測値 24 5. 02 1 1
    [0340] 実施例 37
    [0341] 2— （2—ナフチル） 一ら一ヒ ドロキシべンゾォキサゾ ールの合成
    [0342] 温度計および冷却用コ ンデンサーを付けた三ッ ロフ ラスコに、 2—ナフ トェ酸クロライ ド 2 0 g ( 1 04. 9議 1) と 4一ア ミ ノ レゾルシノール塩酸塩 2. 5 g: ( 1 5. 5 iniol) を入れ、 1 3 5〜 2 0 5てで 1時間加 熱した後、 過剰の酸クロライ ドを蒸留で除いた。 残渣に、 N a 0 H 8. 3 s (207. 5πιιπο1) 、 T H F 6 0 mK 水 60ml、 メ タノール 30mlを加え、 室温で約 2時間撹 拌した。 反応液を酢酸ェチルで抽出し、 飽和食塩水で洗 浄した後、 過剰の酢酸ェチルを留去した。 残渣を水 Zメ タノール ZTH Fで再結晶した後、 結晶を乾燥し、 2—
    [0343] ( 2—ナフチル） 一 6—ヒ ドロキシベンゾォキサゾール 1. 2 rag ( 7. 36 oiniol) を得た。 反応収率は 4 7. 5 %であった。
    [0344] m. p. ： 226. 0〜 226. 2 °C
    [0345] I R (第 1 6図、 K B r、 cm 17) ：
    [0346] 3050s 1620、 1485、 1450、 1303、 1141、 1116、 816、 752 NMR (第 1 7図、 DM S O— d 6 ) ：
    [0347] 6.92 (dd, 1H) 、 7.17 ( d , 1H) 、 7.64 ( m , 3H) 、 8.08 ( in , 4H) 、 8.74 ( s , 1H) 、 9.92 ( s , 1H) MS (E I ) : 26 1 (M + ) 、 1 30
    [0348] 高分解能 MS (E I ) ： 17Hn02 N
    [0349] 計算値 26 1. 082 5
    [0350] 実測値 26 1. 0807
    [0351] 実施例 38
    [0352] 2— （2, 4—ジクロロフヱニル） 一 6—ヒ ドロキシべ ンゾォキサゾールの合成
    [0353] 温度計および冷却用コンデンサーを付けた三ッロフラ スコに、 2, 4—ジクロ口安息香酸クロライ ド 9. 9 ml ( 7 0. 5 ππιοΐ) と 4一ア ミ ノ レゾルシノール塩酸塩 2. 0 g ( 1 2. 4ιπιηο1) を入れ、 1 7 2〜 247。Cで 1時間加熱した後、 過剰の酸ク ロライ ドを蒸留で除い た。 残渣に、 N a O H 6. 47 g- ( 1 6 1. διηιποΐ) 、 T H F 60 ml 水 60 ml、 メタノール 3 0 mlを加え、 室 温で約 2時間撹拌した。 反応液を酢酸ェチルで抽出し、 飽和食塩水で洗浄した後、 過剰の酢酸ェチルを留去した 残渣を水 Zメ 夕ノール ZT H Fで再結畢した後、 結晶を 乾燥し、 2— (2, 4—ジクロ口フエニル） 一 6—ヒ ド ロキシベンゾォキサゾ一ル 9 1 5 nig ( 3. 27 ιππιοϊ) を 得た。 反応収率は 26. 3 %であった。
    [0354] m. p. 21 2. 5〜2 1 2. 8。C I R (第 1 8図、 K B r、 cm 17 ) ：
    [0355] 3150、 1638、 1611、 1564、 1489、 1464、 1325、 1232.
    [0356] 1094、 822、 808
    [0357] N M R (第 1 9図、 D M S O— d 6 ) ：
    [0358] 6.92 (ddf IH) 、 7.11 ( d , 1H) 、 7.66 ( in , 2H) ,
    [0359] 7.85 (dd, 1H) 、 8.12 ( d , 1H) 、 9.97 ( s , 1H)
    [0360] M S ( E I ) : 2 7 9 (M + ) 2 8 (M + + 2 )
    [0361] 2 8 3 (M + + 4 ) 、 1 7 2、 1 3 9 1 0 8、 8 0、 5 2
    [0362] 高分解能 M S ( E I ) ： C i3H7 ° 2 N C 1 2
    [0363] 計算値 2 7 8. 9 8 9 8
    [0364] 実測値 2 7 8. 9 8 7 6
    [0365] 実施例 3 9
    [0366] ルミ ノールと 2— （3—クロ-口フエニル） 一 6— ヒ ドロ キシベンゾォキサゾールと使用するペルォキシターゼの 発光ァッセィー
    [0367] 2 0 0 のルミ ノール溶液 （ l O O mM D M S O 溶液 1 0 ノ 1 O ml、 0. 1 M— ト リス塩酸塩緩衝液 P H 8. 5 ) と実施例 3 5で得られた 2 0 0 ] の 2 一 （ 3 —ク ロ口フエニル） 一 6 — ヒ ドロキシベンゾォ キサゾール溶液 （ 1 0 0 m M D M S O溶液 1 0 j Z 1 0 ml、 0. 1 M— ト リス塩酸塩緩衝液 p H 8. 5 ) と 1 0 ί の西洋わさびペルォキシターゼ （H R Ρ ) 溶液 〔 1 1 1 ：！ ^^ を丄 £：ノ£ の B S Aを含有する Ρ Β S緩衝液 （ρ Η 7. 0 ) で 1万倍に希釈〕 と 1 0 z j の 過酸化水素溶液 （ 9. 1 M水溶液を 1 0 0 0倍に希釈） とをプラスチックキュべッ トに入れ、 3秒間ボルテック スミキサーで撹拌した後、 1分後の発光強度を測定した, 次に、 H R Pを含まない P B S緩衝液 （p H 7. 0) 1 0 μύ. とノレミ ノール、 2— （3—ク ロ口フエニル） 一 6 — ヒ ドロキンべンゾォキサゾールを上記量混合撹拌 し、 1分後の発光強度で測定した。 前者と後者の比を、 シグナル Ζバックグラウン ド比 （S Ν比） として表 7に 示した。
    [0368] 実施例 4 0. 4 1
    [0369] 実施例 4 0、 4 1 と して、 実施例 3 9のルミ ノールの 代わりにイソルミ ノール （実施例 40) 、 Ν— （4ーァ ミ ノブチル） 一 Ν—ェチルイソルミノール （Α Β Ε Ι ) (実施例 4 1 ) を用いる以外は、 実施例 3 9と同様にし て発光強度を測定し、 表 7に示した。
    [0370] 実施例 42
    [0371] ルミ ノールと 2— （4一ク ロ口フエニル） 一 6— ヒ ドロ キシベンゾォキサゾ ルと使用するペルォキシターゼの 発光ァッセィ
    [0372] 20 0 βίί のルミ ノ ール溶液 （ l O O mM DM S O 溶液1 0 ^£ 1 01111、 0. 1 M— ト リス塩酸塩緩衝液 p H 8. 5) と実施例 3 6で得られた 2 0 0 ίί の 2— (4一 ク ロ 口フ エ二ノレ） 一 6 — ヒ ドロキシベンゾォキ サゾール溶液 （ l O O mM D M S O溶液 1 0 〃 £ 1 0ml、 0. 1 M— ト リス塩酸塩緩衝液 p H 8. 5 ) と 1 0 μ& の西洋わさびペルォキシターゼ （ H R Ρ ) 溶液 〔 1 1 1 1 unitZmgを 1 g Zi の B S Aを含有する P B S緩衝液 （p H 7. 0 ) で 1万倍に希釈〕 と 1 0 の 過酸化水素溶液 （ 9. 1 Μ水溶液を 1 0 0 0倍に希釈） とをプラスチックキュベッ トに入れ、 3秒間ボルテック スミキサーで撹拌した後、 1分後の発光強度を測定した。
    [0373] 次に、 H R Ρを含まない P B S緩衝液 （ρ Η 7. 0 ) 1 0 μ & とノレミ ノール、 2 — （4一ク ロ口フエニル） 一 6— ヒ ドロキシベンゾォキサゾールを上記量混合撹拌 し、 1分後の発光強度で測定した。 前者と後者の比を、 シグナル/バックグラウン ド比 （ S Ν比） と して表 7に 示した。
    [0374] 実施例 4 3、 44
    [0375] 実施例 4 3、 44と して、 実施例 4 2のルミ ノールの 代わり にイ ソルミ ノール （実施例 4 3 ) 、 Ν— （4 —ァ ミ ノブチル） 一 Ν—ェチルイソルミ ノ ール （Α Β Ε Ι ) (実施例 4 4 ) を用いる以外は、 実施例 4 2と同様にし て発光強度を測定し、 表 7に示した。
    [0376] 実施例 4 5
    [0377] ルミ ノールと 2 一 ( 2—ナフチル） 一 6—ヒ ドロキシべ ンゾォキサゾールと使用するペルォキシターゼの発光ァ ッセィ
    [0378] 2 0 0 のルミ ノール溶液 （ l O O mM D M S O 溶液 1 0 〃^ // 1 01111、 0. 1 M— ト リ ス塩酸塩緩衝液 P H S . 5 ) と実施例 3 7で得られた 2 0 0 j の 2 一 （2—ナフチル） 一 6—ヒ ドロキシベンゾォキサゾ一 ル溶液 （ l O O mM D M S 0溶液 1 0 z i Z 1 0 ml、 0. 1 M— ト リス塩酸塩緩衝液 p H 8. 5) と 1 0 の西洋わさびペルォキシターゼ （HR P ) 溶液 〔 1 1 1 1 unitZmgを 1 g の B S Αを含有する P B S緩衝液 (p H 7. 0) で 1万倍に希釈〕 と 1 0 ^ i の過酸化水 素溶液 （9. 1 M水溶液を 1 0 0 0倍に希釈） とをブラ スチックキュべッ トに入れ、 3秒間ボルテックスミキサ 一で撹拌した後、 1分後の発光強度を測定した。
    [0379] 次に、 HR Pを含まない P B S緩衝液 （p H 7. 0) 1 0 & とルミ ノール、 2— （2—ナフチル） 一 6—ヒ ドロキシベンゾォキサゾールを上記量混合撹拌し、 1分 後の発光強度で測定した。 前者と後者の比を、 シグナル Ζバックグラウン ド比 （S Ν比） と して表 7に示した。 実施例 46、 4 7
    [0380] 実施例 4 6、 47として、 実施例 4 5のルミ ノールの 代わりにイソルミ ノール （実施例 46 ) 、 Ν— （4ーァ ミ ノブチル） 一 Ν—ェチルイソルミ ノール （Α Β Ε Ι ) (実施例 4 7 ) を用いる以外は、 実施例 4 5と同様にし て発光強度を測定し、 表 7に示した。
    [0381] 実施例 48
    [0382] ノレミノー と 2一 （2， 4ニジクロ口フエニル） 一 6— _t ド αキシベンゾォキサプールと使用するペルォキシタ ーゼの発光アツセィ
    [0383] 2 0 0 £ のルミ ノール溶液 （ 1 0 0 m M DM S O 溶液 1 0 ^ j ノ 1 0 ml、 0. 1 M— ト リ ス塩酸塩緩衝液 p H 8. 5 ) と実施例 3 8で得られた 2 0 0 £ の 2 — ( 2 , 4—ジクロロフヱニル） 一 6—ヒ ドロキシベンゾ ォキサゾール溶液 （ l O O mM D M S 0溶液 1 0 β / 0 m 0. 1 M - ト リ ス塩酸塩緩衝液 p H 8. 5 ) と Ι Ο ^ ΰ の西洋わさびペルォキシターゼ （H R P ) 溶 液 〔 1 1 1 1111111 1^を 1 gr /J の B S Aを含有する P
    [0384] B S緩衝液 （p H 7. 0 ) で 1万倍に希釈〕 と 1 0 z j の過酸化水素溶液 （9. 1 M水溶液を 1 0 0 0倍に希釈） とをプラスチックキュベッ トに入れ、 3秒間ボルテック ス ミキサーで撹拌した後、 1分後の発光強度を測定した。
    [0385] 次に、 H R Pを含まない P B S緩衝液 （p H 7. 0 )
    [0386] 1 0 β とノレミ ノール、 2 — （2 , 4—ジクロ口フ エ二 ル） 一 6—ヒ ドロキシベンゾォキサゾールを上記量混合 撹拌し、 1分後の発光強度で測定した。 前者と後者の比 を、 シグナル Ζバックグラゥン ド比 （ S Ν比） と して表
    [0387] 7に示した。
    [0388] 実施例 4 9、 5 0
    [0389] 実施例 4 9、 5 0と して、 実施例 4 8のルミ ノールの 代わりにイソルミ ノール （実施例 4 9 ) 、 Ν - (4ーァ ミ ノブチル） 一 Ν—ェチルイ ソルミ ノール （Α Β Ε Ι )
    [0390] (実施例 5 0 ) を用いる以外は、 実施例 4 8と同様にし て発光強度を測定し、 表 7に示した。
    [0391] 比較例 1 9〜2 1
    [0392] 比較例 1 9〜 2 1 と して、 実施例 3 9〜 4 1 の 2 — ( 3—クロ口フ エニル） 一 6—ヒ ドロキシベンゾォキサ ゾールを使用しない以外は、 全ぐ同様にして発光強度を 測定し、 表 7に示した。
    [0393] t t
    [0394] J1 n 表 7 ェンハンサ一と 2, 3—ジヒ ドロ一 1, 4一フタラジンジオン （DPD)
    [0395] の組合せによるシグナル対バックダラゥンド比 （S N比）
    [0396] e e
    [0397] 木 111 を10倍希釈して得られた発光強度を 10倍した値
    [0398] U H R Pを 20倍希釈して得られた発光強度を 20倍した値
    [0399] C
    [0400] CJ1 表 7 (続き）
    [0401] 0
    [0402] U HRPを 20倍希釈して得られた発光強度を 20倍した値
    [0403] 実施例 51
    [0404] 2—ェ トキシカルボ二ルー 6 ドロキシベンゾォキサ ゾールを用いた C A 1 5— 3抗原の発光ァッセィ
    [0405] C A 1 5— 3抗原溶液 （61 5 UZini) を 0. 25% ゥシ血清アルブミ ンを含むリ ン酸塩緩衝液 （P B S ) で 希釈し、 S O O UZm 200 U/mK 1 00 U/mK 50 U/ml, 25 U/mK O UZml (0. 25%ゥシ血 清アルブ ミ ンを含む P B S ) の濃度の溶液に調製し、 各 々を標準 C A 1 5 - 3溶液と した。
    [0406] 各濃度の標準 C A 1 5— 3溶液を 20 iii ずつ、 ト レ (25穴） に分注した。 ペルォキシダ一ゼ標識抗 C A 1 5— 3抗体 （マウス） を 300 ί ずつゥエルに加え た。 各ゥェルに抗体不溶化ビーズを14紙で付着液を吸い 取った後、 ピンセ ン トで 1個ずつ加えた。
    [0407] ト レイカバーシールを貼り、 軽く たたいて混合した後、 25 °Cで 2時間反応させた。 反応終了後、 ビーズゥォ ッ シヤーを用い、 生理食塩水 5mlで 3回洗浄した。 洗浄後、 ト レイ中のビーズを試験管に移し、 さ らにルミ ノ メータ 一測定用プラスチッ クキュべッ トに移動させた。
    [0408] 1 00 ί のノレ ミ ノ ーノレ N a塩溶液 （ 1 2. 6 mM、 ル ミ ノ ール N a塩/ 1 M— ト リ ス塩酸塩緩衝液 p H 8. 5の溶液を同緩衝液で 18倍に希釈） と 1 00 /ζ£ の 2—ェ トキシカノレポ'ニノレー 6—ヒ ドロ千シベンゾォキ サゾール溶液 （ 1 0 0 m M D M S 0溶液： 1 0〃 i Z 1 0 m 0. 1 M— ト リ ス塩酸塩緩衝液 p H 8. 5) と 1 0 0 の過酸化水素溶液 （16. 2 β Μ過酸化水素 Ζ 0. 01 Μリ ン酸水素 2ナト リ ウム · クェン酸緩衝液 ρ Η 5. 2を同緩衝液で 18倍に希釈） をプラスチック バイアルに加え、 37てで 10分間加温した後、 60秒 間発光を測定した。 50秒から 60秒の間の発光強度の 積算値の 1 /6の値を、 表 8に示した。
    [0409] 標準 C A 15 - 3抗原溶液 （300 X1,1111、 200 U Zml、 100 U/mK 50 U/mK 25 U/ml) の 50 秒から 60秒の間の発光強度の積算値の 1 Z 6の値と、 0 U mlの 50秒から 60秒の間の発光強度の積算値の 1 Z6の値の比 （S N比） を求め、 表 8、 第 20図に示 した。
    [0410] 比較例 22
    [0411] 実施例 35の手順に従い、 2—ェトキシカルボ二ルー 6—ヒ ドロキシベンゾォキサソールを使用しなかった以 外は全く同様に操作し、 発光強度および S N比を表 8、 第 20図に示した。
    [0412] t
    [0413] cn CD 表 8 CA15— 3の分析 50秒から 60秒の問の発光 の 積算値の · ~の値および SN比
    [0414] D
    [0415] CA15-3 (U/ml)
    [0416] ェ ン ノヽ ン サ一
    [0417] 0 25 50 100 200 300 発光強度
    [0418] 2—ェ卜キシ^;ノレポ' 151 763 2729 18333 54503 94172
    [0419] 麵値）
    [0420] 実施例 51 ニル一 6—ヒドロキン
    [0421] ベンゾォキサゾール S N 比 1 4.86 17.4 117 347 600 発光強度
    [0422] 250 329 397 968 1422 8625 (相対値）
    [0423] 比較例 22 な し
    [0424] S N 比 1 1.32 1.59 3.87 5.69 34.5
    [0425] 産業上の利用可能性
    [0426] 以上のように本発明にかかる発光分析方法により、 物 質の高感度迅速測定が可能となる。
    权利要求:
    Claims

    請 求 の 範 囲
    . (a) ペルォキシダーゼまたはペルォキシダーゼ誘導 体、 （b) 酸化剤および （c)ルミ ノール、 イソルミ ノー ルまたはそれらの誘導体の反応により生ずる化学発光 を利用して、 物質を検出または測定する方法において, 誘発光反応を 2—ヒ ドロキシー 9一フルォレノ ン、
    0H および
    一般式
    〔式中、 は水素、 Cn H2n+1 (こ こで、 nは 1〜 4の正の整数を表わす） 、 X C n H2n (こ こで、 Xは F C l、 B rまたは Iを表わし、 n = l〜4の正の整数を 表わす） 、 Cn H2n+1C 02 (nは前記定義に同じ） 、 フエニル基、 ナフチル基、 Cn H ofl+1C 6 H4 (nは前 記定義に同じ） 、 Y C P H^ (¥は？、 じ 1 、 8 1"、 I またはフエ二ル基を表わす） 、 X Y C 6 H 3 (X、 Yは 前記定義に同じ） を表わす〕
    で示されるォキサゾール誘導体からなる群から選ばれる 少なく とも 1つの化合物の存在下に行なう ことを特徴と する高感度発光分析方法。
    2. —般式 [ I ] に示される化合物の 1 ェ が水素、 メチ ノレ基、 クロロメチル基、 エ トキシカルボニル基、 フ エ ^ル基、 ブロモフエニル基、 メチルフエニル基、 クロ 口フエニル基、 ナフチル基またはジクロロフエニル基 である請求項 1記載の高感度発光分析方法。
    3. — 般 式 な • R [Π]
    HOへ、 " x
    〔式中、 R0 は X Cn H2n (ここで、 Xは F、 C 1、 B r または Iを表わし、 n = 1〜 4の正の整数を表わ す） 、 Cn H2n+1C 02 (nは前記定義に同じ） 、 ナフ チル基、 Cn H n+1 C β Η4 (ηは前記定義に同じ） 、 Y C g H4 (Yは F、 C l、 B r、 I またはフエニル基 を表わす） 、 XY C6 H8 (X、 Yは前記定義に同じ） を表わす〕
    で示される新規なォキサゾール誘導体。
    4. 一般式 [H] に示される化合物の R2 がクロロメチ ノレ基、 エトキシカルボニル基、 ブロモフエニル基、 ク ロロフェニル基、 ナフチノレ基、 ジクロロフエ二ル基ま たはメチルフヱニル基である請求項 3記載の新規なォ キサゾール誘導体。
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    JP22957589||1989-09-05||
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